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至质谱检测法与蛋白质分析的“前世今生”

2021-09-19 | 公司新闻
质谱检测法与蛋白质分析的“前世今生”

质谱分析法是蛋白质研究领域和生物大份子研究领域中重要的分析技术。由于我们对蛋白质鉴定、定量和分析的要求愈来愈高,希望检测技术的灵敏度也愈来愈高,同时能够对更加复杂的样品进行分析处理,因此推动了质谱检测技术的发展,出现了1大批新兴的质谱分析方法和仪器。本文将对近几年质谱技术的发展和质谱技术在蛋白质领域研究工作中的利用进行1个详细的介绍。

在生命科学研究工作中有1个重要问题,就是发现、鉴定蛋白质并弄清楚它们的1级结构。知道了蛋白质的氨基酸序列信息,我们就能够通过遗传密码将其与编码序列对应起来,从原则上来讲,也就将细胞的生理学与遗传学联系起来了。发现、鉴定出了1个蛋白质就好像给我们打开了1扇窗,透过这个窗口,我们就可以够对复杂的细胞调控网络有所了解。

在基因组学大步发展之前,我们就已能够使用化学方法或酶学方法来鉴定蛋白质的1级结构了,不过当时只能对单1的、高度纯化的蛋白质进行分析。我们当时通常采取的方法都是检测紫外线吸光度或荧光光谱分析的方法。比如用化学逐渐降解法,即Edman法来鉴定时是从蛋白质多肽的N端逐渐降解至C端,在降解的进程中通过检测紫外线吸光度的办法来辨认每个被降解下来的氨基酸残基。不过在近20年里,有1种新方法质谱检测法开始逐渐进入到蛋白质鉴定领域。质谱法与化学法结合,为我们提供了更多有用的信息。随着质谱技术的进步,质谱法逐步成了蛋白质鉴定方面的方法。到了上世纪90年代中期,质谱检测法已取代了Edman法,成为鉴定蛋白质1级结构的主流方法。

随着人类基因组项目的展开,大家对质谱技术的需求也变得愈来愈大。人类基因组项目让我们看到,我们可以对复杂的生物系统进行全面的高通量分析。而且人类基因组项目还向我们提供了大量的完全基因编码序列,这对帮助我们大量、快速鉴定蛋白质序列来讲意义重大。因而,继基因组项目以后,又迅速出现了蛋白质组学的概念,即对细胞或组织中的所有蛋白质进行系统研究。在蛋白质组学研究中,质谱技术一样是必不可少的1项重要技术。

不过要对所有的蛋白质进行分析实在是1项非常辣手的任务。虽然我们的技术在不断进步,但到目前为止,我们还不可能对任何1个物种的所有蛋白质进行分析。该任务大的难点在于任何1个蛋白质组都非常复杂,而且我们对其复杂程度1无所知。我们所知道的是,任何1个物种蛋白质组组成单位的数量都要远远超过其基因组中所有基因的数量。

这是由于,1个基因可以通过可变剪接的方式、序列多态性方式、翻译后修饰方式和其它蛋白质处理机制等构成多个蛋白质。而且,这些数量众多的蛋白质各自的浓度差别也非常大,目前没有1款仪器或方法能够对动态范围如此大的样本群体进行分析。比如我们曾预计血清蛋白质的浓度差别可能超过了10个数量级。虽然分析血清蛋白这个任务也非常困难,但是这还是推动了蛋白质及蛋白质组学分析技术的发展。本文将向您介绍几种质谱检测技术,它们在蛋白质分析领域的利用情况,并对它们在蛋白质组学研究工作中的价值进行讨论。

质谱检测仪和它们的利用范围

长时间以来,质谱技术只能用来分析1些耐热的小化合物,由于我们当时还没法有效地、温和地使样品离子化,也没法有效地在不致使样品断裂的条件下将离子化的样品从固态转变成气态。在上世纪80年代末诞生了两项技术进步,即电喷射离子化技术和基质辅助激光解析离子化技术。这两项技术解决了生物大份子的离子化问题,它们的出现,极大地推动了质谱技术的发展,我们终究可使用质谱技术来分析蛋白质组成问题了。随后又催生出了1大批新型的用于蛋白质和蛋白质组学研究领域的质谱检测仪,比如Q-Q-ToF质谱仪和ToF-ToF质谱仪等。质谱仪不但能够检测蛋白质多肽的份子量和氨基酸序列,还能发现蛋白质的结合位点和翻译后修饰情况。在检测蛋白质多肽的份子量和氨基酸序列时,使用单级质谱仪就足够了,而在发现蛋白质的结合位点和翻译后修饰情况时除进行单级质谱检测以外,还会选择特殊的离子通过碰撞对其进行裂解分析。在这类串连质谱检测实验中,我们可以通过对蛋白质裂解片断的分析获得详细的蛋白质结构信息。我们下面将要介绍的质谱仪都是在蛋白质研究中经常使用到的仪器。这些质谱仪之间在物理原理、性能指标、操作模式和利用范围方面各有差异。

至质谱检测法与蛋白质分析的“前世今生”

表1 各种常见质谱仪性能简介;表中 表示具有该功能,表示可选该功能。+、++和+++分别表示可能或适度、好或很好、优秀或非常优秀;Seq表示连续的。

飞行时间质谱仪和hybrid ToF质谱仪

在ToF质谱仪中,我们可以通过某个离子飞越1段长度真空管道的时间推算出它的质荷比。现在,ToF质谱仪的性能已得到了很大的提升,特别是在分辨率和准确性方面进步为明显。现在,分辨力超过12,000已是质谱仪的常规标准了。如果依照正确的操作规程,也能够到达百万分之1级别的准确率。ToF质谱仪是进行ESI质谱和MALDI质谱检测的基础平台。Q-Q-ToF质谱仪在MS模式和MS/MS模式下就具有非常高的分辨率和准确率。在MS模式下,4级杆起到了引导离子飞行的作用。而在MS/MS模式下,母离子,即在ESI进程中产生的离子被挑选出来,进入对4级杆,而后在第2对4级杆中借助碰撞引诱解离作用被裂解。然后,裂解离子产物经过ToF质谱仪进行分析处理。不论是完全扫描模式还是MS/MS模式,得到的质谱图都具有很高的准确率和分辨率,这也就意味着能取得更多的肽段信息,发现单1同位素信号的离子状态和指派信息。所有这些信息都给蛋白质鉴定工作带来了极大的便利。有了上述这些信息,再与数据库中的数据进行比对,就可以找出检测蛋白质样品的资料。Q-Q-ToF质谱仪在定量分析方面和蛋白质翻译后修饰情况分析方面的能力也一样出色。

MALDI技术是另外一项非常有用的待测蛋白质样品离子化技术,通常都会将MALDI技术与ESI技术相互补充使用。MALDI质谱仪灵敏度非常高,同时,对样品污染的要求没有ESI质谱仪那末刻薄。开始,MALDI技术是与ToF质谱仪联合使用用来检测蛋白质份子量的。后来又被利用到Q-Q-ToF质谱仪和ToF-ToF质谱仪上,这样才实现了真实的MS/MS检测。在单电荷母离子的质谱图和ToF-ToF质谱仪得到的质谱图中都能发现高能量的碰撞裂解片断,这些片断都是蛋白质多肽肽键断裂和侧链断裂构成的,这些信号都很容易被解析。

离子阱质谱仪

在离子阱质谱仪中,可以捕获离子,因此也能够积累离子。离子阱技术具有没有法比拟的高灵敏度和快速数据收集能力。将离子阱技术与数据依赖性收集技术结合起来,我们就可以进行高通量的质谱检测。不过,离子阱质谱仪的分辨率有限,捕获离子的能力不高,再加上空间电荷效应的影响,因此离子阱质谱仪的检测准确度不够高。改进型的线性离子阱质谱仪具有更高的离子捕获能力,更宽阔的动态范围和更高的灵敏度。现在,线性离子阱质谱仪已取代了传统的4级杆捕获装备。我们通常都会使用线性离子阱质谱仪中的慢速扫描功能来提高分辨率。离子阱质谱仪也都具有多阶段连续MS/MS功能,有了这类功能,我们能够反复分离、裂解某些离子片断,这是发现诸如磷酸化等翻译后修饰情况的好方法。

线性离子阱质谱仪技术已被应用到3重4级杆质谱仪当中,这类新型的质谱仪具有了许多新的功能。Q-Q-LIT质谱仪就是这类3重4级杆质谱仪,它具有母离子扫描功能和中性丢失扫描功能,同时该质谱仪的敏感度也有所提高。这些新型的质谱仪为我们提供了分析蛋白质翻译后修饰情况的利器。另外,Q-Q-LIT质谱仪具有的多重反应监测能力能够帮助我们发现母离子与某1片断之间的转换情况。将这类MRM技术与高效能循环结合起来,就可以取得的敏感性,并且能够进行定量分析。

Ion source:离子源;MS1:个质谱仪;CID:碰撞引诱解离;MS2: 第2个质谱仪;

Product ion scanning:离子产物扫描法;fixed:固定; scanning:扫描;m/z:质荷比;

Precursor ion scanning: 母离子扫描法;time:时间;

Neutral loss scanning: 中性丢失扫描法;Multiple ion monitoring: 多离子监测法;

至质谱检测法与蛋白质分析的“前世今生”

图1 各种串连质谱检测方法原理示意图。

A:离子产物扫描法是蛋白质组学研究里经常使用的MS/MS质谱检测策略。该方法的目的就是要取得蛋白质片断离子的质谱图,然后据此鉴定出蛋白质的氨基酸序列。在本实验中,个质谱仪MS1是用来挑选出某1特定的母离子。随后,被选出的母离子在碰撞池中经过碰撞引诱解离作用被进1步裂解成更小的片断,然后这些小片断份子经过第2个质谱仪MS2进行分析、鉴定。对不同的母离子反复进行这类分析终就能够取得蛋白质的完全氨基酸序列。

B:母离子扫描法。在这里,第2个质谱仪MS2只对1个母离子进入检测。个质谱仪MS1对所有母离子进行扫描后挑选出1个母离子进入MS2。通常来讲,该方法适用于检测某1样品中包括特殊功能基团的蛋白质亚群,这些基团包括磷酸酯基团或糖基化修饰基团等。

C:性丢失扫描法能够以同步的方式同时对两种待测样品进行分析。份子量不同的各种离子可以延续不断地通过MS1和MS2。在碰撞池中,不符合份子量要求的中性片断份子都被筛掉了。因此,该方法适用于分析样品中具有某种特定功能的多肽。该方法常利用的领域是发现被磷酸化修饰的丝氨酸或苏氨酸位点。

D:离子监测法是由1系列的实验组成的。MS1和MS2会分别挑选出1母离子和1特定的能代表该母离子的片断份子。然后,经过1系列的实验转化操作,后搜集实验信号以供结果分析。MRM方法合适对复杂样品中已知片断特性的特定样品进行分析。

离子回旋加速器与轨道离子阱质谱仪

随着功能强大的带有外部离子源的傅里叶变换-离子回旋加速器质谱仪的出现和商业化,我们在质谱仪的分辨率与准确性方面获得了质的奔腾。有了这类新型的质谱仪,我们现在可以对ppm级乃至亚ppm级的样品进行分析了。该质谱仪的高分辨率特性不但提高了数据结果的质量,同时也增加了峰容量,因此相比传统的低分辨率质谱仪,FT-ICR质谱仪能够获得更多的信息。配有外部LIT装备的杂交 FT-ICR质谱仪的发展更是提高了该质谱仪的分析能力,同时也赋予传统的低分辨率MS/MS质谱仪更好的探测母离子的能力。将FT-MS质谱仪与LIT-ICR杂交质谱仪结合,就可以取得真正意义上的平行全质谱检测仪MS1和串连质谱仪MS2。高质量的MS1检测结果可以用于定量研究。这类策略的缺点就是相对照较低的数据收集速度和IT装备酿成的动态范围较窄。

近,出现了1种新型的轨道离子阱质谱仪。这是30年来上市的款使用新物理技术的质谱仪,该质谱仪能分离振荡电场中的离子。在分辨率和准确率方面轨道离子阱质谱仪与FT-ICR质谱仪不相上下,但是它不需要FT-ICR质谱仪使用的昂贵的超导磁铁。

MS-MS操作模式

串连质谱仪通常使用的都是离子模式来鉴定蛋白质的氨基酸序列。目前所有的MS/MS质谱仪都具有该功能。不过表1中罗列的其它特殊的质谱仪也具有MS/MS功能。如果要发现蛋白质中的某个功能基团则需要用到母离子扫描功能或中性丢失扫描功能,而这就必须用到3重4级杆质谱仪,如,Q-Q-Q质谱仪,或4级杆离子阱质谱仪,如,Q-Q-LIT质谱仪。比如复杂混合物里的蛋白质磷酸化位点和糖基化位点就都可以用这类方法检测出来。在1个典型的质谱检测实验中,首先先用母离子扫描或中性丢失扫描都能发现目标组分,然后再用传统的MS/MS方法鉴定蛋白质的氨基酸序列和定位修饰位点。

3重4级杆质谱仪在MRM模式下也能以极高的敏感度进行定量分析。已知的或未知的分析物都以极高的敏感度和选择性能被定量检测出来。这类高选择性得益于质谱仪能够对代表1个肽段的1对母离子和片断裂解物它的高刚性(曲折模量提升50%)也带来轻浮化和节省材料的可能性离子进行实时监测。而且,在MRM模式下进行的两轮选择进程会极大地提高检测的灵敏度,由于,轮挑选过后只能剩下很少的离子,这也就将背景噪声减小到了低水平。碰撞引诱解离片断离子来源于母离子,这些CID离子能够产生离散信号,而背景化学噪声信号则是随机散布的。后,由于这类采样时间很长的技术固有的非扫描本质使得它的敏感度非常高,相比离子扫描技术的探测极限要高出好几个数量级。

质谱仪的性能

我们已在表1中对各种质谱仪的性能进行了1个概括。整体来讲,质谱仪的性能包括分辨率、敏感度或探测极限和准确性等,这些性能都与质谱仪的类型、采取的离子化方法和扫描能力有关。不过没有哪个仪器能同时在上述所有方面都全面占优,在选择仪器的时候必须根据实验需要进行相应的取舍。

对实验仪器性能的比较1直以来都是1个存在很多争议的话题。由于性能是服务于需求的,是取决于待测样品和实验步骤的。质谱仪对单独肽段样品进行检测时敏感度总是很低,不过如果生物样品的基质背景很高,那末检测的敏感度就会提高好几个数量级。这类同1款仪器在性能上表现出来的不稳定性其实很常见,在仪器处于不同操作条件或状态下时它们的性能表现都是不同的。实验目的是:想进行定量分析还是蛋白质鉴定,这也决定了该使用哪一种仪器。在蛋白质鉴定实验中,仪器的分辨率和准确性是主要的,而在定量研究中,敏感度、动态范围和MRM能力才是主要的。因此,我们应当根据实验目的的需要和实验设计安排来肯定该使用哪一种质谱仪。

要想用全扫描模式获得定量数据的同时再用MS/MS模式获得定性数据是1件非常困难的事情。不过某些杂交质谱仪,比如LIT-ICR质谱仪,由于它们能够平行收集数据,因此可以部份解决上面那个问题。的定量分析需要源自全部洗脱图的高质量的、高信噪比的数据信息。数据质量与数据收集参数高度相干,这些数据收集参数包括扫描时间或采样时间。因此,我们常常需要在数据质量和样品处理能力之间做出取舍。

新进展

近又有几项有关质谱仪的新进展问世,这些新成果的出现又给我们的生物大份子研究工作补充了弹药。在蛋白质测序方面,基于碰撞引诱裂解技术,又新出现了可变裂解技术,该新技术是基于处在碰撞池中的离子具有的电子传递特性开发出来的。目前,电子捕获解离技术和电子传递解离技术都已分别被利用到FT-ICR质谱仪和LIT质谱仪上了。应用这两种技术产生的蛋白质裂解产物能与经典的CID方法裂解产物互为补充。不过这两种新方法裂解更均匀,更合适用于发现翻译后修饰情况。ECD技术和ETD技术还都可以用于大型肽段和蛋白质的研究。他们的裂解能力和对完全蛋白的分析能力可以帮助我们直接用质谱仪对完全的蛋白质进行分析,便可以采取所谓的自上而下的方法进行研究。这样,我们能够取得完全的氨基酸序列信息和翻译后修饰信息,能够对蛋白质进行准确的鉴定。

传统的和新的蛋白质组学研究策略

虽然到目前为止,还没有1种蛋白质组学研究策略能够对某个蛋白质组进行常规的、完全的分析,但是现在的技术已非常强大,我们相信,很快就可以进行全蛋白质组学研究了。而且,对某个亚蛋白质组进行研究早就已不是甚么困难了,这已成了1种常规的研究手段。不过,蛋白质组学研究方法也使得各接口布局工整公道需要视研究目的而做出相应的调剂,不能千篇1律,比如,有很多研究都是描写性的研究项目,主要的关注点都着眼在发现、鉴定出蛋白质和这些蛋白质的翻译后修饰情况,而近又开始逐步兴起蛋白质组学定量研究了。

实际上,每个以质谱检测为基础的蛋白质组学研究工作都包括以下3大部份:分离、消化蛋白质样品,然后对样品进行进1步裂解;对样品进行质谱定性和定量检测;用相应的软件对质谱检测结果进行分析处理,取得蛋白质的氨基酸序列,并且如果可能的话,进行定量分析。蛋白质的鉴定工作主要由MS-MS质谱仪负责,然后通过将质谱检测结果与数据库中的数据进行比对,后肯定出蛋白质的氨基酸序列。需要提示的是,对结果的统计分析工作是保证结果正确性的关键。

对纯化蛋白进行质谱分析

下面,我们用古老的蛋白质组学研究方法2维凝胶电泳法结合质谱分析法对纯化蛋白进行质谱分析的策略为例进行介绍。首先,待测目标蛋白经消化、酶解以后经过质谱仪进行鉴定,通常使用的都是MALDI-ToF质谱仪来获得肽链指纹图谱。近,出现了好几种该策略的改进方法,行将各种连续电泳分离方法或色谱分离方法结合进来,以提高质谱检测时的峰容量,这样就提高了对复杂样品的分辨率。定量分析则是在蛋白质水平通过比较不一样品中目标蛋白的信号强度来完成的。这类策略的优劣取决于它们辨别相干蛋白质的能力,即分辨率的高低,比如要能够辨别出经不同类型修饰的蛋白质,还取决于待测样品的复杂程度。这类研究策略大的问题是动态范围太窄,而且处理样品的能力也不够高,不具有高通量分析的功能,因此不足以进行蛋白质组学研究。而且,1些比较重要的蛋白质,比如膜蛋白等还不能用该方法进行分析,由于该方法只能用于分析复杂度比较低的样品,或用于对某1特定蛋白进行分析的实验。

对复杂样品进行质谱检测

对复杂样品进行质谱检测时也用到了人类基因组研究项目中用到的鸟枪法策略。即首先将蛋白质组样品进行裂解,这样取得的多肽片断才能够用于自动化MS/MS分析,我们经常使用的是快速扫描装备如IT质谱仪。用这类方法可以对完全细胞裂解物或组织提取物进行分析,也能够对亚细胞结构、提纯的细胞器或其它亚蛋白质组样品进行检测。

如果给待测样品带上稳定的同位素标记,我们就能够对样品中不同蛋白质的丰度进行检测了,这些蛋白质可能在化学性质方面是1样的,但是我们可以通过不同的同位素信号强度比对它们进行辨别。也能够使用如图3B中所示的串连标记方法对样品进行屡次质谱分析。还可以在进行质谱分析之前往待测样品中添加定量的同位素标记肽段,以取得样品准确的定量数据。

这类鸟枪法大的优势就是简单,不论从理论层面来讲还是从实验操作层面来讲都很简单,该方法相比前面所述的各种方法能够对蛋白质组分进行更大程度的覆盖,同时定量的准确性更高。不过该方法也有其局限性,具体表现在动态范围不够,难以使用生物信息学方法从大量的、高冗余的、复杂的蛋白质组样品质谱数据中推断出蛋白质序列。幸亏这些问题已部份得到了解决,通过裂解的方法可以下降样品的复杂程度。经常使用的裂解方法主要针对的都是蛋白质组中生物信息学资料丰富的部份,比如富含半胱氨酸的肽段、磷酸化的肽段、糖基化的肽段等等。这类鸟枪法策略合适用于快速鉴定复1035以来杂样品中的组分,也非常合适用于对不一样品中同1蛋白质的定量比较研究。在鸟枪法策略中,在蛋白质水解进程里,不同肽段间的联系信息和肽段与其来源蛋白质间的联系信息都已丢失了,因此该方法不太合适用于对具有多重修饰的蛋白质进行鉴定工作。

至质谱检测法与蛋白质分析的“前世今生”

Protein:待测蛋白质样品;Enz.Digestion:酶解;Pep. Mixture:裂解产物混合物;

MS Analysis:质谱检测分析;DB Search:数据库比对搜索;Identities:鉴定;

Prot.DB :蛋白质数据库;Proteome:蛋白质组;Sample prep:样品准备;

LC/MS MS/MS:LC/MS和 MS/MS分析;Quantification:定量研究;

Abundances:丰度;List of targets:挑选出待测样品;Pep.lib:待测靶样品;

图2 蛋白质组学研究策略示意图。

A:经过2维电泳或pull-down实验发现的待测蛋白质样品prot随即被酶解,然后用质谱仪对酶解片断pep进行质谱检测分析。后根据肽质指纹图谱鉴定出肽段和它们的来源蛋白。其它的MS/MS数据也能用来进行肽段鉴定。

B:随机蛋白质鉴定和定量分析方法,即鸟枪法。该方法可以对样品同时进行鉴定和定量研究。被选出的肽段如图1A中所示,经过串连质谱仪进行离子扫描分析。在这里,母离子是被随机选出的,通常母离子的裂解片断中只有1个片断能够被检测到,也就是说存在采样不足的问题。MS1质谱仪收集准确到的离子强度信息与参考份子信息比对可以进行定量分析,这里使用的参考份子通常都会标记上稳定的同位素标签。

C:定量研究方法能去除蛋白质定量研究与鉴定进程中的干扰信号。首先,MS1质谱仪会通过比对不一样品的肽模式,即肽段份子量相对色谱保存时间作图的结果,挑选出不一样品间丰度不同的肽段。然后被挑出的肽段进入下1轮MS/MS质谱检测。

D:基于各种假说的检测方法。该方法可以对各种预先被设定肽段的丰度进行高精度的检测,我们通常都是根据以往的实验结果来挑选这些靶肽段。在这里经常使用的方法是图1D中所示的MRM方法。如果在实验当选用适合的参考肽段会进1步提高实验的准确性。

比较模式分析

图2C中所示的比较模式分析法其实在原理上与2维电泳方法是类似的,就像在2维电泳中1样,每个蛋白质都是1个独立的点,可以借此对它们进行定量和定性的分析。而且还可以进1步对蛋白质进行分析,比如进行蛋白质测序或进行翻译后修饰情况鉴定等。不过在以质谱检测手段为基础的分析方法中,蛋白质样品首先需要被降解、片断化,然后再用液相色谱-质谱仪LC/MS进行分析。借助色谱洗脱时间和份子量这两个参数,我们就能够鉴定出1个多肽离子。将所有离子的数量信息整合起来就得到了蛋白质的定量信息。这类方法主要的优势在于它可以对质谱仪发现的所有信息进行定量处理。与鸟枪法相比这是非常明显的优势,由于在鸟枪法里,只能对被鉴定出来的肽段进行定量化处理。不过在实际应用进程中,这类比较模式分析方法的重复性很差,也没有非常好的配套软件对检测结果进行分析。用这类方法可以取得1些数据,根据这些数据能够推测出蛋白质序列,这些数据包括质荷比、带电荷状态、洗脱时间和离子强度等。需要被测序的多肽会出现在检测结果列表中,然后,我们会将该蛋白进行新1轮的直接质谱检测,专门只收集它的MS/MS质谱图信息。这类研究方法也可用于MALDI/MS/MS质谱检测平台,由于蛋白质样品都被固定在样品板上,因此可以对它们进行不受时间限制的连续检测。

基于各种假说的研究策略

随着各种质谱仪技术的不断进步,我们有理由相信会出现敏感度更高、处理速度更快、更可靠的蛋白质组研究装备。不过目前我们还不清楚这些技术上的进步是不是足以突破当下蛋白质组学研究工作中的瓶颈。之前我们曾认为蛋白质组学研究策略需要进行有效的变革才能全面、有力的对蛋白质组进行研究和分析。这类变革的核心就是改变以往那种在每次实验中都对既往结果进行重复研究的蛋白质组学研究方法,新的研究策略是根据既往的研究成果来设计、指点进行新的实验研究项目。我们预计与人类基因组计划1样,将来也会取得某个物种的完全蛋白质组序列图谱,未来蛋白质组的研究目标应当是对蛋白质进行具有特定目的的、非冗余的分析研究。对质谱技术和质谱仪器的发展来讲,这类研究策略的转变需要有更好的检测装备和检测手段做依托,要能够以更快的速度、更高的灵敏度和更强大的分析能力进行质谱检测。现在也出现了可供序列组装、修饰情况查询的数据库。可以预计,在不久的将来,各种生物学假说将会给我们设定出许多待检测的蛋白质靶标。我们可以将这些蛋白质的信息录入数据库,构成1个检测这些假说所必须的极小集蛋白质信息簇。然后,可以用各种方法,比如MRM方法对这些蛋白质进行检测。由于这类研究方法主要是对非冗余靶标进行质谱检测,所以,在检测的敏感度方面和样品处理能力方面都有很大的提高。如果再配合定量的、标准化的同位素标记参考肽段,还可以进行的定量分析。

上述这类研究策略合适用于Q-Q-LIT质谱仪这类被我们使用了几10年,主要用于检测小份子药品和体内药物代谢研究领域的3重4级杆质谱仪。在研究药物代谢时使用的研究方法一样适用于蛋白质组学研究领域。

作为上述方法的1个补充,Smith又开发出另外一种使用份子量标签来鉴定蛋白质的方法。该方法首先测定待测物资的份子量,然后将数据与份子量数据库进行比对,以此来鉴定蛋白质。这样就无需再对每个样品中的每条多肽进行测序了。随着蛋白质组学研究的不断展开,我们积累的数据也愈来愈多,并且数据积累的速度也愈来愈快,同时,各种分析软件的功能也愈来愈强大,因此我们相信,基于各种假说的蛋白质组学研究策略1定会被更多的人所接受,所采取。

至质谱检测法与蛋白质分析的“前世今生”

Labeling:标记 Tag:标记物 Peptide:肽段 Mixing:混合 Analysis:分析

MS:质谱检测 light:较轻的片断 heavy:较重的片断 Time:时间

Tandem mass tag:串连标签 MS/MS:MS/MS模式 m/z:质荷比

No labeling!:为标记 MRM:MRM方法

Internal standards:内参,即同位素标记的肽段

图3 肽段定量分析策略示意图

A:同位素稀释法是进行肽段定量分析经常用的1种方法,该方法也是进行蛋白质组学研究经常用的1个方法。该方法的原理是在1号样品所有的待测蛋白质上都带上1个稳定的同位素标签,同时在2号样品所有的待测蛋白质上都带上另外一个稳定的同位素标签。这样,这两组样品就能够互为参照了。可以借助化学的方法,例如稳定的同位素编码标签试剂、代谢标记反应和酶标反应等对蛋白质进行同位素标记。

B:使用串连标签进行定量研究。该方法一样需要各种稳定的同位素标记物。这些同位素标记物由两种同位素标记元素组成,它们都有固定的份子量。目前,这些试剂可用于4通道反应。通过在质谱仪的MS/MS模式下检测连接在蛋白质N端报告基团的相对强度和CID图谱中低份子量范围里的信号可以取得待测蛋白质的定量信息。

C:使用内参进行定量研究的方法。该方法实际上也是1种同位素稀释法。在该方法中会往待测样品中添加1种已知浓度的同位素标记的肽段,然后借助标准曲线进行的定量分析。虽然该方法样品制备进程较为复杂,但是它的前景非常光明。它非常合适用于基于各种假说的检测方法。

小结

在过去的10年里,是蛋白质分析,更准确的说应当是蛋白质组学分析推动了质谱检测技术的发展。各种技术进步已使质谱仪在准确度、分辨力、敏感度、定量分析能力等各方面都有了长足的进展,蛋白质组质谱检测策略方面也有了新突破。分析完全蛋白质、蛋白质复合体、低丰度蛋白质等各种样品的检测操作流程层见叠出。

编辑点评

质谱分析法是蛋白质研究领域和生物大份子研究领域中重要的分析技术。质谱检测技术推动了生物大份子领域的研究。因此,我们有理由相信,质谱检测技术势必在生物研究的各个领域里占有重要的1席之地。